一、外植體的采集及處理
秋天(9~10月)挖地黃地下直徑約1.0cm,挖無病蟲害的強(qiáng)根莖,用洗滌靈和自來水洗凈,切成1.0~1.5cm長根。在超凈工作臺上用75%的酒精沖洗30%,用0.1%的水銀消毒7~8毫米,用無菌水沖洗5~6次。
二、誘導(dǎo)外植體生長與分化
用滅菌剪刀或解剖刀去除與消毒液接觸的斷面,并暴露新鮮組織。根段立即接種到培養(yǎng)基MS6-BA0.05~2.0mg/LNAA0.01~0.5mg/L。請注意不要把下端朝上。接種的材料在溫度24℃左右、光12h/d、光強(qiáng)度1500lx下培養(yǎng)。接種1周后,根部開始出現(xiàn)黃綠芽點(diǎn),15d左右出現(xiàn)不定芽,30-40天后芽出現(xiàn)2.0~3.0cm。
三、繼代增殖
取下上述芽苗,接種培育基MS6-BA1.5mg/LNAAO.1mg/L,10分鐘后芽苗基部產(chǎn)生芽叢(3~5分鐘),20~30分鐘后新芽生長到1.0~2.0分鐘左右。每30天左右繼代一次,增殖系數(shù)控制在3倍左右,保持芽苗良好增殖,同時獲得壯苗。
四、生根與移栽
將高達(dá)3.0cm左右、成長結(jié)實(shí)的無根苗分為單株接種到培育基礎(chǔ)12MSNAAA0.05mg/L,一般在15天后產(chǎn)生大量根系。根長約1.0cm時,可馴化移植。方法是將試管苗放在溫度25℃、濕度75%的玻璃溫室里,用鑷子輕輕地從瓶子里取出苗,用稀釋0.125%~0.142%藥液的百菌清洗剩下的瓊脂培養(yǎng)基,移植到消毒處理的基質(zhì)(珍珠巖:蛭石=1:1)。移植后的溫度保持在24~25℃,濕度在80%以上,成活率在90%以上。