回答一抗的孵育時(shí)間與溫度、抗體濃度有關(guān)。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時(shí)左右。在室溫的條件下，孵育3小時(shí)左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時(shí)左右。如果一抗的濃度過(guò)高或者是孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹底而出現(xiàn)非特性顯色。

一、一抗孵育時(shí)間，不能超過(guò)多久

1、一抗的定義

一抗指的是能夠和非抗體性抗原（特異性抗原）特異性結(jié)合的蛋白，也就是平常所說(shuō)的抗體。二抗指的是能和抗體結(jié)合的抗體，主要用于檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào)。

2、一抗的孵育時(shí)間

（1）一抗的孵育時(shí)間與溫度，抗體濃度有關(guān)。一般情況下，在37℃的條件下，孵育1-2小時(shí)左右。在室溫的條件下，孵育3小時(shí)左右。在4℃的條件下，孵育18-24小時(shí)左右。

（2）如果一抗的濃度過(guò)高或者是孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附，增加洗滌的難度，最終因洗滌不徹底而出現(xiàn)非特性顯色。

二、雙抗體夾心法檢測(cè)未知抗原

1、包被

用0.05M碳酸鹽包被緩沖液（ph9.6）對(duì)抗體進(jìn)行稀釋，直至蛋白質(zhì)含量為1-10μg/ml為止。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。第二天的時(shí)候，去掉孔內(nèi)溶液，然后用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。

2、加樣

將0.1ml經(jīng)過(guò)稀釋的待檢樣品放到反應(yīng)孔中，在37℃的環(huán)境條件下孵育1小時(shí)，然后進(jìn)行洗滌。

3、加酶標(biāo)抗體

在各個(gè)反應(yīng)孔中，加入0.1ml新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體，在37℃的環(huán)境條件下，孵育0.5-1小時(shí)，然后進(jìn)行洗滌。

4、加底物液顯色

在各個(gè)反應(yīng)孔中，加入0.1mlTMB底物溶液（應(yīng)當(dāng)臨時(shí)配制），37℃的環(huán)境條件下10-30分鐘。

5、終止反應(yīng)

在各個(gè)反應(yīng)孔孔中，加入0.05ml的2M硫酸。

6、結(jié)果測(cè)試

（1）在白色背景下，用肉眼進(jìn)行觀察即可。反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。

（2）在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，如果大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。